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基因甲基化概念

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產品應用說明

甲基化是指從活性甲基化合物(如 S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物,或是對某些蛋白質或核酸等進行化學修飾形成甲基化產物。在生物係統內,甲基化是經酶催化的,這種甲基化涉及重金屬修飾、基因表達的調控、蛋白質功能的調節以及核糖核酸(RNA)加工。 



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釋義
甲基化是指從活性甲基化合物(如 S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物,或是對某些蛋白質或核酸等進行化學修飾形成甲基化產物。在生物係統內,甲基化是經酶催化的,這種甲基化涉及重金屬修飾、基因表達的調控、蛋白質功能的調節以及核糖核酸(RNA)加工。 [1]

類型
甲基化包括 DNA 甲基化或蛋白質甲基化
(1)DNA 甲基化。脊椎動物的 DNA 甲基化一般發生在 CpG 位點(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點,即 DNA 序列中胞嘧啶後緊連鳥嘌呤的位點)。經 DNA 甲基轉移酶催化胞嘧啶轉
化為 5-甲基胞嘧啶。人類基因中約 80%-90%的 CpG 位點已被甲基化,但是在某些特定區域,如富含胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG島則未被甲基化。這與包含所有廣泛表達基因在內的56%的哺乳動物基因中的啟動子有關。1%-2%的人類基因組是 CpG 群,並且 CpG 甲基化與轉錄活性成反比。

(2)蛋白質甲基化。蛋白質甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次(稱為一甲基精氨酸)或兩次(精氨酸甲基轉移酶(PRMTs)將兩個甲基同時轉移到精氨酸多肽末端的同一個氮原子上成為非對稱性甲基精氨酸,或者在每
個氮端各加一個甲基成為對稱性二甲基精氨酸)賴氨酸經賴氨酸轉移酶的催化可以甲基化一次、兩次或三次。在組蛋白中,蛋白質甲基化是被研究最多的一類。在組蛋白轉移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到組蛋白。某些組蛋白殘基通過甲基化可以抑製或激活基因表達,從而形成為表觀遺傳。蛋白質甲基化是翻譯後修飾的一種形式。

功能
甲基化是蛋白質和核酸的一種重要的修飾,調節基因的表達和關閉,與癌症、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關,是表觀遺傳學的重要研究內容之一。最常見的甲基化修飾有DNA 甲基化和組蛋白甲基化。

DNA 甲基化能關閉某些基因的活性,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。DNA甲基化能引起染色質結構、DNA 構象、DNA 穩定性及 DNA 與蛋白質相互作用方式的改變,從而控製基因表達。研究證實,CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化導致了人體 1/3 以上由於堿基轉換而引起的遺傳病。DNA 甲基化主要形成 5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的 N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及 7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出現在CpG 序列、CpXpG、CCA/TGG 和 GATC 中。

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DMT) 的催化下,以 s-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基轉移到特定的堿基上的過程。DNA 甲基化可基因甲基化的概念

以發生在腺嘌呤的 N-6 位、鳥嘌呤的 N-7 位、胞嘧啶的 C-5 位等。但在哺乳動物中 DNA 甲基化主要發生在 5’-CpG-3’的 C 上生成 5-甲基胞嘧啶(5mC)。在哺乳動物中 CpG 以兩種形式存在:一種是分散於 DNA 序列中;另一種呈現高度聚集狀態,人們稱之為 CpG 島(CpG island)。在正常組織裏,70%~90%散在的 CpG 是被甲基修飾的,而 CpG 島則往往是非甲基化的(除有些特殊區段和基因外)。正常情況下,人類基因組“垃圾”序列的 CpG 二核苷酸相對稀少,並且總是處於甲基化狀態,與之相反,人類基因組中大小為 100-1000bp 左右,富含 CpG 二核苷酸的 CpG 島則總是處於未甲基化狀態,並且 CpG 島常位於轉錄調控區附近,與 56%的人類基因組編碼基因相關,因此基因轉錄區 CpG 島的甲基化狀態的研究就顯得十分重要。人類基因組序列草圖分析結果表明,人類基因組 CpG 島約為 28890 個,大部分染色體每 1Mb 就有 5-15 個 CpG 島,平均值為每 Mb 含 10.5 個 CpG 島,CpG 島的數目與基因密度有良好的對應關係。DNA 甲基化主要是通過 DNA 甲基轉移酶家族來催化完成的。研究人員在真核生物中發現了 3 類 DNA 甲基轉移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1 一種是維持性甲基化酶;Dnmt2 可與 DNA 上特異位點結合,但具體作用尚不清楚;Dnmt3a 和 Dnmt3b 是重新甲基化酶,它們使去甲基化的 CpG 位點重新甲基化,即參與 DNA 的從頭甲基化。在哺乳動物的生殖細胞發育時期和植入前胚胎期,其基因組範圍內的甲基化模式通過大規模的去甲基化和接下來的再甲基化過程發生重編程,從而產生具有發育潛能的細胞;在細胞分化的過程中,基因的甲基化狀態將遺傳給後代細胞。由於 DNA 甲基化與人類發育和腫瘤疾病的密切關係,特別是 CpG 島甲基化所致抑癌基因轉錄失活問題,DNA 甲基化已經成為表觀遺傳學和表觀基因組學的重要研究內容。

組蛋白甲基化是指發生在 H3 和 H4 組蛋白 N 端 Arg 或 Lys 殘基上的甲基化,由組蛋白甲基轉移酶介導催化。組蛋白甲基化的功能主要體現在異染色質形成、基因印記、X 染色體失活和轉錄調控方麵。除了存在組蛋白甲基轉移酶以外,還發現了去甲基化酶。先前人們認為組蛋白的甲基化作用是穩定而不可逆的,使這種去甲基化酶的發現使組蛋白甲基化過程更具動態性。

基因甲基化的概念

檢測方法
(1) 甲基化特異性的 PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組 DNA,所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變;隨後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物,如果用針對處理後甲基化 DNA 鏈的引物能得到擴增片段,則說明該位點存在甲
基化;反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。

(2)亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組 DNA,則未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。隨後設計 BSP 引物進行 PCR,在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶,最後對 PCR 產物進行測序就可以判斷 CpG 位點是否發生甲基化稱為 BSP-直接測序方法。將 PCR 產物克隆至載體後進行測序,可以提高測序成功率,這種方法稱為 BSP-克隆測序法。

(3) 高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting,HRM)在非 CpG 島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾後的 DNA 雙鏈的引物,這對引物中間的片段包含感興趣的 CpG 島。若這些 CpG 島發生了甲基化,用亞硫酸氫鹽處理後,未甲基化的胞嘧啶經 PCR 擴增後轉變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變,樣品中的 GC 含量發生改變,從而導致熔解溫度的變化。

(4) 基因組直接測序法
基因組直接測序法是過去一直沿用的 DNA 甲基化的研究方法,用 Maxam—Gilbert 化學裂解法對基因組 DNA 進行處理,並以連接介導的 PCR 來放大信號強度,然後進行序列分析。此法是基於 5mC 在標準的 Maxam—Gilbert 胞嘧啶化學裂解反應中不被裂解,故 5mC可通過在測序膠上缺少對應於胞嘧啶降解反應產物的一個條帶而得以鑒定。如采用 MnO4- 呱啶法,結果則反之因此在檢測5mC時,此兩法可提供完全互補的檢測信息。該法與LM—PCR結合後,大大降低了對基因組 DNA 的需要量(1~2 ng)。當 5mC 和 C 同時處於不同 DNA
分子上的同一位點時,該位點至少要有 25%的 5mC 才能被 N2H4法檢測到;MnO4-法比 N2 H4法更靈敏。因為這兩種基因組 DNA 化學修飾法均有抑製 DNA 聚合酶延伸的特性,無須進行 DNA 呱啶裂解就可通過基因組直接測序技術進行甲基化分析。

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